Полимеразная цепная реакция

Подготовка к исследованию

Анализ на ПЦР является самым быстрым и достоверным способом на ранних этапах обнаружить инфекцию, но бывают и ложноположительные/ложноотрицательные результаты.

Для сохранения нервной системы как своей, так и сотрудников медицинского учреждения, следует правильно подготовиться к исследованию.

из влагалища производят мазок.

Ограничения метода

Тем не менее не стоит думать, что ПЦР-диагностика не имеет недостатков. У нее есть свои ограничения, но их количество настолько незначительно, что не может отрицательно повлиять на популярность и эффективность метода:

  • Вероятность амплификации ДНК не только живого, но и погибшего микроорганизма . При проведении ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения необходимо соблюдать определенные требования. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1–2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции в организме.
  • Возможность возникновения перекрестной реакции . Подбор фрагментов ДНК (праймеров) осуществляется на основе знаний о генетическом строении конкретного микроорганизма. Но теоретически такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован. Их присутствие в пробе может привести к ложноположительному результату анализа.
  • Изменчивость микроорганизмов . Эта способность возбудителей к мутации иногда приводит к тому, что некоторые их штаммы становятся неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Чтобы уменьшить риски, разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Объем материала 2 3 мм 3.

Полимеразная цепная реакция – руководство для начинающих

ПЦР — это метод современных лабораторий молекулярной биологии. Если вам нужно скопировать, упорядочить или количественно определить ДНК, вам необходимо знать ПЦР. Короче говоря, полимеразная цепная реакция — это биохимический метод, использующий термоциклирование и ферменты для быстрого и надежного копирования ДНК.

Эта статья дает краткий, базовый обзор ПЦР с несколькими советами, которые помогут вам избежать наиболее распространенных ошибок. Если вы новичок или имеете мало опыта в проведении ПЦР, то статья для вас. И даже если у вас есть опыт в ПЦР, стоит его немного освежить, и, возможно, получить один или два полезных совета.

Если вы новичок или имеете мало опыта в проведении ПЦР, то статья для вас.

ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции

В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач.

Как расшифровать ПЦР анализ

Проведение ПЦР исследования позволяет не просто установить тип инфекции, присутствующий в организме больного, но и оценить его с количественной точки зрения (количество микробов). Расшифровка результатов количественного анализа ПЦР играет важную роль в обнаружении и проверке эффективности лечения большого числа хронических заболеваний, скажем гепатита C.

Результатом анализа ПЦР могут стать положительный и отрицательный ответы.

  • Отрицательный результат. Следы инфекции не были выявлены в биологическом материале, который являлся объектом исследования в процессе анализа ПЦР. Как правило, на основании отрицательного результата можно полагать, что в организме действительно отсутствует инфекция.
  • Положительный результат. Такой результат анализа ПЦР свидетельствует о том, что следы инфекционного заболевания присутствуют в биологическом материале пациента. Положительный результат анализа ПЦР характеризуется большой степенью точности.

Иногда инфицирование выявляется на фоне полного здоровья и отсутствия признаков заболевания. Некоторые больные считают, что анализ сделан неправильно, но реальная ситуация другая. Если ПЦР показала, что возбудитель в организме есть, значит, он там действительно находится. Просто инфекционные болезни никогда не начинаются сразу после заражения, имея инкубационный период различной продолжительности.

Скрытый период может продолжаться очень долго, например, при СПИДе – несколько лет, пока какие-то механизмы не подтолкнут вирусы к размножению. Возбудитель определяется в организме носителей и тех, кто не долечился. Очень часто переходят в скрытую (латентную) форму различные ЗППП. В этом случае может понадобиться дополнительная лабораторная диагностика.

Очень часто переходят в скрытую латентную форму различные ЗППП.

Что такое ПЦР-тесты и зачем их сдавать

Полимеразная цепная реакция — метод, позволяющий обнаружить конкретный генетический материал в образце. В качестве образца можно взять почти что угодно: от анализа крови пациента до древних костей или окурков из пепельницы на лестничной площадке. Например, сотрудники криминалистических лабораторий применяют ПЦР-тест , чтобы по частичкам ДНК с места преступления установить личность преступника или его жертвы. Это почти как отпечатки пальцев, только не рук, а генетического материала.

В отличие от криминалистов, врачей обычно интересуют две вещи:

  1. «Личность» микроскопических преступников — вирусов и бактерий, которые вызвали заболевание у пациента.
  2. Особенности строения генома пациента — например, у людей с лейкозами при помощи ПЦР-тестов определяют мутации гена MPL.

Но генетические анализы нужны не так уж часто, поэтому в статье мы будем говорить про ПЦР-анализы на инфекции.

Как работает ПЦР-анализ. У большинства живых существ на нашей планете, за исключением некоторых вирусов с РНК-геномами, генетический материал представляет собой длинную двухцепочечную молекулу ДНК.

Цепочка ДНК состоит из «звеньев» — нуклеотидов. Это четыре небольшие молекулы, строение которых универсально для всех живых существ. Из одного и того же набора нуклеотидов можно собрать геном вируса оспы, человека или синего кита. Вся разница — в порядке, в котором нуклеотиды идут в цепочке ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов для участка ДНК какой-нибудь болезнетворной бактерии, мы можем засечь его присутствие в биологическом материале. А поскольку этот порядок уникален, мы не перепутаем его с человеческой ДНК.

Читайте также:  Как давать Супрастин детям? Инструкция по применению

Во время полимеразной цепной реакции кусочек чужеродного генетического материала из образца при помощи особого белка-фермента размножают много-много раз. В результате получается столько ДНК, что ее хватает для успешной идентификации.

Для каждого микроорганизма набор реактивов нужен свой. Поэтому врачи назначают не ПЦР-анализ вообще, а исследование на конкретный микроорганизм. Так что ПЦР-тест на гепатит С не поможет найти в образце еще и хламидии.

ПЦР-анализы бывают качественные и количественные. Качественные позволяют понять, есть ли в образце генетический материал бактерии или вируса, который мы ищем. А количественные — сколько именно там этого материала. Если сделать несколько таких тестов во время лечения, станет ясно, действует ли на микробов назначенное лекарство.

В результате получается столько ДНК, что ее хватает для успешной идентификации.

В чем суть полимеразной цепной реакции?

ПЦР-исследование – это достижение и огромная заслуга молекулярной биологии. Это – метод, который, обнаружив микроучастки ДНК или РНК чужеродного генетического материала (генома), способен распознать индивидуальные характеристики, присущие только одному виду микроорганизмов, не спутав его ни с каким другим. Как же работает метод ПЦР и как ему удается восстановить картину поведения инфекционной клетки в живом организме?

процесс проведения ПЦР

Итак, фрагмент нуклеиновой кислоты найден, но он один и для проведения реакции его явно недостаточно, поэтому он кодируется (копирование). Однако для дальнейшего процесса необходимо большое количество таких микроучастков, что может обеспечить его размножение путем достраивания новых, идентичных найденному фрагменту, участков ДНК (репликация). Размножение является естественным и неотъемлемым свойством нуклеиновой кислоты, которая будет реплицироваться с помощью фермента полимеразы даже вне живого организма (в пробирке с пробой), образуя множество клонов, то есть, пойдет цепная реакция. Клонироваться будут все новые и новые фрагменты, но только те, в которых заинтересован исследователь. Вот почему так важно взять «чистый», без посторонних примесей анализ, а тест проводить очень аккуратно.

Учитывая перечисленные способности полимеразной цепной реакции, можно догадаться, почему она так легко отличает уреаплазму от микоплазмы, или каждую из них от хламидии.

Таким образом, даже если среди миллионов клеток человеческого организма затеряется не сам живой вирус, а лишь частица его ДНК, то ПЦР, если ей ничто не помешает, пожалуй, справится с задачей и сообщит о пребывании «чужака» положительным результатом. В этом суть ПЦР и ее основное достоинство.

Итак, фрагмент нуклеиновой кислоты найден, но он один и для проведения реакции его явно недостаточно, поэтому он кодируется копирование.

ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)

Точно такие же принципы лежат в основе ПЦР в реальном времени. Но вместо того, чтобы оценивать продукты амплификации на геле после проведения реакции, за этим процессом можно наблюдать «онлайн». Обеспечивается это тем, что образец, помещенный в амплификатор, на протяжении всего процесса находится под наблюдением специальной камеры, которая называется детектором.

Существует множество технологий мониторинга процесса ампификации, но суть у них одна: при синтезе каждой новой копии ДНК возникает флуоресцентный сигнал, который улавливается детектором. Чем интенсивней флуоресценция, тем больше продуктов амплификации находится в образце.

ПЦР в реальном времени имеет множество преимуществ перед обычной ПЦР:

  • Во-первых, за реакцией возможно наблюдать с самого начала и сразу увидеть, в каких образцах реакция запустилась успешно, а в каких – нет.
  • Можно очень точно рассчитать эффективность реакции.
  • Нет необходимости проводить гель-электрофорез, так как все показатели реакции будут четко показаны на амплификационной кривой.
  • Самым большим преимуществом является возможность проводить полноценно количественную оценку экспрессии генов. Обычная ПЦР является, в лучшем случае, полуколичественным методом анализа.

Можно очень точно рассчитать эффективность реакции.

ПРЕИМУЩЕСТВА

Метод ПЦР стал «золотым стандартом» при диагностике ряда заболеваний.

Главное преимущества метода – это его чувствительность. ПЦР позволяет выявить возбудителей в тех случаях, когда из за сверхмалого количества они недоступны для других методов.

Благодаря особенности ПЦР, позволяющей выявлять даже единичные экземпляры возбудителей в биологическом материале, метод особенно ценен в диагностике латентных и хронических форм заболеваний.

Возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов очень сложно обнаружить другими методами, а ПЦР дает такую возможность.

Также огромным достоинством метода является его быстрота, т.к весь процесс, начиная с выделения вирусной или бактериальной ДНК из пробы, занимает всего несколько часов. В то время, как трудоемкий метод выращивания визуализируемых колоний возбудителя в лабораторных условиях может занимать несколько дней. Практически полная автоматизация метода сводит к минимуму вероятность ошибок, связанных с ручной подготовкой и тестированием проб.

Читайте также:  Помощь при отеке Квинке

Метод эффективен при диагностике трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм патогенных бактерий.

Также метод может быть использован для тестирования объектов внешней среды.

Специфичность метода составляет 100%.

Метод используется не только в диагностике, но и в наблюдении за динамикой течения заболеваний, т.к. позволяет определять число копий возбудителя в пробе и, тем самым, контролировать виремию или бактеремию в процессе лечения. Что позволяет своевременно оценить эффективность лечения и произвести необходимые корректировки.

Очень важно, что при проведении исследования методом ПЦР практически исключается возможность инфицирования персонала во время проведения анализа, т.к. исследуемый материал может быть дезинфицирован химически или термически в момент забора.

к весь процесс, начиная с выделения вирусной или бактериальной ДНК из пробы, занимает всего несколько часов.

Анализ крови

Кровь в качестве биоматериала для тестирования берут при подозрении на ВИЧ, вирусный гепатит, токсоплазмы, половой герпес и цитомегалию. Для большинства этих патогенов до использования этого метода диагностика базировалась на выявлении антител к возбудителю, что сильно затягивало время обнаружения микробов в тот период, когда антитела еще не вырабатываются.

Перед сдачей крови для диагностики в данном случае не нужны особые приготовления, но лучше, если проба будет отобрана натощак. Единственное обстоятельство, способное серьезно исказить результаты — прием антибиотиков, поэтому сдаче должен предшествовать временной отрезок после приема подобных лекарств в несколько дней или недель в зависимости от типа антибиотика.

В самых современных клиниках в последнее время для отбора крови на ПЦР используют вакуумные системы, которые минимально повреждают кожные покровы и сводят к минимуму вероятность попадания в пробу загрязняющих агентов из воздуха, инструментов или рук лаборантов.

Вариаций такой ПЦР диагностики существует много.

ПЦР-диагностика

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).

Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки.

ПЦР (полимеразная цепная реакция). Как производится ПЦР диагностика, показания, как подготовиться к исследованию, результат ПЦР

Как производится ПЦР диагностика, показания, как подготовиться к исследованию, результат ПЦР.

Диагностика туберкулеза методом ПЦР

  • Лечащие врачи дают пациентам направление на данное обследование для уточнения диагноза в спорных случаях.

Заражение паразитами;.

Основные принципы

Итак, ПЦР – это многократное копирование определенных фрагментов ДНК in vitro в процессе повторяющихся температурных циклов. Как же протекает процесс реакции в пределах одного температурного цикла?

Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Однако для начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают “праймеры” (затравки) – синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК – двуцепочечная, то и матриц изначально две). Таким образом, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, определенного праймерами. Структуру отдельного цикла можно представить следующим образом:

  1. денатурация ДНК (плавление, расхождение цепей ДНК) – 95°С – 1 или 2 минуты;
  2. отжиг праймеров (затравки связываются с ДНК-матрицей, температура данной стадии определяется нуклеотидным составом праймера) – 60°С (к примеру) – 1 минута;
  3. элонгация ДНК (полимераза синтезирует цепь ДНК) – 72°С – 1 минута (время зависит от длины синтезируемого фрагмента).

Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой.

Полимеразная цепная реакция

Генетика бактерий. Информация для второго занятия.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция – метод, позволяющий провести многократное увеличение (амплификацию) количества определенных молекул ДНК в анализируемом образце (в том числе в биологическом материале или чистой культуре).

Главные преимущества ПЦР как диагностического метода в микробиологии – очень высокая чувствительность, позволяющая обнаружение крайне малых концентраций возбудителей в образцах, а такжерегулируемая специфичность, позволяющая обнаруживать или идентифицировать возбудителей на родовом, видовом или субвидовом уровне. Основной недостаток ПЦР вытекает из его крайне высокой чувствительности – образы очень легко загрязнить ДНК из положительного контроля, другого образца или продукта ПЦР, что приведет к ложноположительной реакции. Это накладывает жесткие ограничения на условия, в которых производится смешивание ПЦР и работа с готовыми продуктами ПЦР.

Проведение ПЦР. Готовится реакционная смесь, содержащая следующие компоненты:

Выделенную ДНК из исследуемого образца,

Ионы Mg2+ (необходимы для работы фермента),

Два праймера – одноцепочечныекороткие молекулы ДНК (длина чаще всегоот 18 до 24 нуклеотидов), комплементарные концам разных цепей обнаруживаемой последовательности ДНК.

Читайте также:  Как правильно принимать соду для повышения потенции

Термостойкую ДНК-полимеразу (чаще всего используется Taq-полимераза – полимераза, выделенная из Thermus aquaticus ).

Затем данная реакционная смесь помещается в амплификатор, который фактически представляет собой программируемый термостат. В амплификаторе проводится 30-40 циклов смены температур. Каждый из этих циклов состоит из трех этапов (см. Рис. 1):

Денатурация (температура 94 о С) – разрываются водородные цепи, и цепочки ДНК расходятся.

Отжиг праймеров (температура обычно в районе 50-60 о С) – к концам цепей ДНК присоединяются праймеры. Вообще, при снижении температуры энергетически выгоднее воссоединение исходных цепей ДНК из исследуемого образца (ренатурация), однако концентрация праймеров в реакционной смеси на много порядков больше концентрации ДНК из образца (по крайней мере, на начальных циклах ПЦР), поэтому реакция отжига праймеров протекает быстрее ренатурации ДНК. Температура отжига выбирается в зависимости от температур плавления (денатурации) праймеров.

Элонгация (температура обычно 72 о С) – ДНК-полимераза достраивает праймеры по матрице длинных цепей ДНК. Температура соответствует оптимальной температуре работы используемой ДНК-полимеразы.

Детекция результатов отличается в различных вариантах постановки ПЦР и описана в разделе «Разновидности ПЦР».

Динамика ПЦР

На ранних циклах ПЦР количество двухцепочечных молекул ДНК, размер которых определяется расстоянием между местами посадки праймеров, удваивается с каждым циклом. Также образуется малое количество более длинных молекул ДНК, которым можно пренебречь (см. Рис 2).

Таким образом, на ранних циклах количество продукта ПЦР описывается формулой m*2 n , где m – исходное количество искомой ДНК в пробе, n – число циклов. Затем реакция выходит на плато. Это происходит из-за накопления продукта реакции, снижения концентрации праймеров и дезоксинуклеотидтрифосфатов, а также за счет повышения концентрации пирофосфата (см. Рис 3).

Разновидности ПЦР

Конвенциональная ПЦР

В данном варианте постановки ПЦР реакция идет заранее выбранное число циклов (30-40), после чего анализируется, произошло ли накопление двуцепочечных молекул ДНК в реакционной смеси.

Данный вариант постановки ПЦР при использовании в качестве способа диагностики является качественным методом. Положительная реакция свидетельствует о наличии хотя бы следовых количеств искомых молекул ДНК в образце. Отрицательная реакция свидетельствует об их отсутствии. Количественная оценка содержания исходных молекул ДНК в образце невозможна из-за выхода реакции на плато.

Основным методом выявления наличия продукта является электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле. Продукты ПЦР разделяются в геле под действием электрического поля в соответствии с их молекулярной массой. В гель добавляется интеркалирующий краситель (флуоресцирующий в связанном с двухцепочечной ДНК состоянии – чаще всего бромистый этидий). Таким образом, при облучении ультрафиолетом можно будет увидеть наличие или отсутствие полоски, соответствующей ДНК необходимой молекулярной массы. При проведении ПЦР в диагностических целях всегда ставятся положительный и отрицательный контроли реакции, с которыми сравниваются образцы (см. Рис. 4).

ПЦР в реальном времени

В данном варианте постановки ПЦР количество продукта ПЦР в реакционной смеси регистрируется постоянно в ходе протекания реакции. Это позволяет построить кривую протекания реакции (см. Рис. 3) и, исходя из неё, рассчитать количество искомых молекул ДНК в образцах.

Один из видов проведения ПЦР в реальном времени – с использованием интеркалирующегокрасителя, который добавляется прямо в реакционную смесь (чаще всего используется SYBRGreen). Другой вид – с использованием одного из видов флуоресцирующих зондов, связывающихся с участком внутри ПЦР-продукта, что позволяет повысить специфичность обнаружения (см. Рис 5).Детекцияфлуоресценции происходит непосредственно в приборе в ходе протекания реакции.

Помимо возможности количественного обнаружения, существуют и другие достоинства ПЦР в реальном времени по сравнению с конвенциональной. Данный вариант ПЦР более прост, быстр, а также не требует открывания пробирок с продуктами ПЦР, что уменьшает вероятность загрязнения других образцов. Основной недостаток – более высокая стоимость амплификатора со встроенной возможностью детекциифлуоресценции по сравнению с обычным.

Цифровая количественная ПЦР

Новый, дорогостоящий и пока малораспространенный вариант ПЦР, позволяющий более точно определять количество ДНК в образце.В данном варианте реакционная смесь, содержащая флуоресцентный краситель, разбивается на огромное число микроскопических объемов (например, капелек в эмульсии). После протекания ПЦР анализируется, в какой доле капелек реакция оказалась положительной и, соответственно, наблюдается флуоресценция. Эта доля будет пропорциональна числу искомых молекул ДНК в образце.

ПЦР с обратной транскрипцией

В данном случае перед тем или иным вариантом ПЦР производится реакция обратной транскрипции (РНК в ДНК) с использованием фермента ревертазы. Таким образом, этот метод позволяет проводить качественное или количественное обнаружение молекул РНК. Это может использоваться для детекции РНК-содержащих вирусов или определения уровня транскрипции (количества мРНК) того или иного гена.

Рисунок 1. Этапы ПЦР. Красным цветом обозначены праймеры.

Рисунок 2.Накопление двуцепочечных молекул ДНК, ограниченных праймерами, в ходе ПЦР.

Рисунок 3.Динамика реакции ПЦР при разных изначальных концентрациях искомых молекул ДНК в пробе. (а) – наибольшая концентрация (б) – промежуточная концентрация (в) – наименьшая концентрация

Количественная оценка содержания исходных молекул ДНК в образце невозможна из-за выхода реакции на плато.

Добавить комментарий